西尼羅河病毒IgG、IgM聯(lián)合診斷試劑盒

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檢查

1.實(shí)驗(yàn)室檢查

白細(xì)胞數(shù)減少，腦炎型者腦脊液中淋巴細(xì)胞增多，蛋白增高。

2.免疫學(xué)檢查

利用血清學(xué)抗體檢測方法，常用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）法，采用患者急性期和恢復(fù)期雙份血清，兩份血清同時進(jìn)行檢測，以恢復(fù)期血清較急性期特異性IgG抗體滴度升高4倍以上為陽性，有助于本病的診斷。

3.病原學(xué)檢查

自潛伏末期至發(fā)病后第5天，從患者血液或腦脊液中分離出病毒，陽性率較高，對新分離病毒的鑒定一般采用已知血清進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。

4.分子生物學(xué)檢查

RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）法檢測，通過設(shè)計西尼羅河熱病毒特異引物對血清或腦脊液標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，陽性率高，具有特異性診斷價值。

用途

西尼羅(WN)病毒IgG ELISA，利用了西尼羅重組抗原檢測人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實(shí)驗(yàn)僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。

概述

 感染了西尼羅病毒會導(dǎo)致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個國家檢測出該病毒。本試驗(yàn)經(jīng)CDC提供的試劑檢驗(yàn)與驗(yàn)證。本試驗(yàn)使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學(xué)指標(biāo)，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個抗原的序列多肽構(gòu)成。

實(shí)驗(yàn)的原理

檢測西尼羅病毒IgG ELISA 是基于兩步夾心法原理制造的。

提供的材料

• 微孔板（96孔 12x8）：即用  每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。

注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。

• IgG樣品稀釋液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。
• IgG陰性質(zhì)控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。
• IgG陽性質(zhì)控：1支 30ul  2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。
• 洗滌液（10X）：1瓶 120ml  2－8℃下保存至使用。
• EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。
• 酶聯(lián)物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
• TMB底物液： 1支 9ml 即用  2－8℃下保存至使用。
• 終止液；1支6ml 即用  2－8℃下保存至使用。

試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。

西尼羅河病毒IgG、IgM聯(lián)合診斷試劑盒

操作步驟：

• 標(biāo)記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。

• 將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個血清樣品使用一個板條的*。
• 品稀釋液按1：300稀釋。

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新合成的蛋白質(zhì)可以用放射  免疫測定Western印跡，體內(nèi)代謝標(biāo)記－免疫沉淀或者細(xì)胞  提取液中酶活性的測定等方法來進(jìn)行分析，如果測定中有  重復(fù)品或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞要經(jīng)過多種不同條件或在一段時間歷  程以內(nèi)取不同時間進(jìn)行處理，就要避免皿與培養(yǎng)皿之間轉(zhuǎn)  染效率的偏差。在這些情況下，轉(zhuǎn)染大片的單層細(xì)胞  （90mm培養(yǎng)皿），培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，再分接  到若干較小的培養(yǎng)皿上。②穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：在非選擇性培養(yǎng)基  中培養(yǎng)18～24h，使所轉(zhuǎn)移基因得到表達(dá)之后，用胰蛋白酶  消化細(xì)胞，種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基在2～  3周內(nèi)每2～4d須更換1次，以便除細(xì)胞殘骸并使抗性細(xì)胞集  落得以生長?？梢钥寺蝹€細(xì)胞集落，增殖后進(jìn)行測定。  可以用冰預(yù)冷的甲醇將仍保留在培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞固定15min  ，再于室溫用10%Giemsa染色15min，zui后用自來水沖洗，  這樣即可得到細(xì)胞集落數(shù)的*記錄。Giemsa染液可用PBS  或水現(xiàn)用現(xiàn)配，并用Whatman 1號濾紙過濾。重新接種細(xì)胞  以便取得分隔良好的細(xì)胞集落所要求稀釋倍數(shù)，主要由穩(wěn)  定轉(zhuǎn)化的效率來決定。